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B-NDG®(B-NSGTM)小鼠 B-NDG®(B-NSGTM)mice)

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1.    B-NDG®(B-NSGTM)小鼠基本信息

     1.1.    正规命名

           NOD-Prkdcscid IL2rgtm1/Bcgen

      1.2.    常规命名

          B-NDG®(B-NSGTM) mice

          B: Biocytogen;

          N: NOD background;

          D: DNAPK(Prkdc) null;

          G: IL2rg knockout.

       1.3.    产品编号

    B-CM-002

1.4.    基因型

   Male: Prkdc (-/-), IL2rg (X-/Y); Female: Prkdc (-/-), IL2rg (X-/X-) 

1.5.    背景概述

B-NDG®(B-NSGTM)小鼠(NOD-Prkdcscid IL2rgtm1/Bcgen)是百奥赛图公司自主开发的,NOD-scid遗传背景的IL2rg基因敲除小鼠,缺乏成熟的T、B和NK细胞,是目前国际公认的免疫缺陷程度高、适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。

• NOD(non-obese diabetes)遗传背景:自发I型糖尿病;其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱;先天免疫系统,如补体系统和树突状细胞功能降低。

• Prkdc null(DNAPK,scid):Prkdc(protein kinase DNA-activated catalytic)基因突变,小鼠的功能性T和B细胞缺失,淋巴细胞减少,表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷(severe combined immunedeficiency,scid)。

• IL2rg null: Interleukin-2受体的gamma链(IL-2R γc,又称CD132)位于小鼠X染色体上,是具有重要免疫功能的细胞因子IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的共同受体亚基,该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低,尤其是NK细胞的活性几乎丧失。
B-NDG®(B-NSGTM)小鼠:综合了NOD-scid-IL2rg null背景特征,具有重度免疫缺陷表型,无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞,细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。

1.6.    小鼠优势

• 世界公认的重度免疫缺陷小鼠

• 与NOD-scid小鼠相比寿命更长,平均长达1.5年

• 对人源细胞和组织几乎没有排斥反应

• 少量细胞即可成瘤,依赖于细胞系或细胞类型

• 无B淋巴细胞泄漏

1.7.   主要应用领域

• 人源细胞或组织移植

• 肿瘤和肿瘤干细胞研究

• ES和iPS细胞研究

• 造血和免疫学研究

• 人类疾病感染模型研究

• 新的人源化动物模型研发

1.8.    B-NDG商标申请

北京百奥赛图基因生物有限公司分别对“B-NDG”进行了第5类、第31类、第42类和第44类进行了商标申请。各字母代表含义:B-Biocytogen; N- NOD background; D- DNAPK(Prkdc) null; G- G: IL2rg knockout。

 图片1.jpg 图片2.jpg

 图片3.jpg 图片4.jpg

第5类:人用药;医用水蛭;医用生物标志物诊断试剂;医用或兽医用微生物培养物;医用营养食物;净化剂;兽医用制剂;杀虫剂;医用填料;兽医用干细胞(截止)

第31类:活动物;活家禽;活鱼;甲壳动物(活的);树木;谷(谷类);植物;植物种子;动物栖息用干草;饲料(截止)

第42类:质量控制;化学研究;生物学研究;临床试验;材料测试(截止)

第44类:医药咨询;医院;人工授精;饮食营养指导;动物养殖;兽医辅助;人工授精(替动物);试管授精(替动物);卫生设备出租;试管授精(截止)

1.9.  表型分析


1.9.1.    小鼠生长曲线

生长曲线.png 


图1. B-NDG®(B-NSGTM)小鼠生长曲线

雌雄小鼠各50只,小鼠3周龄断奶后(出生日期+/- 3天)每周固定日期进行称重,数据收集共8周。

      

   1.9.2. 小鼠血清抗体检测

图2.png

图2. B-NDG®(B-NSGTM小鼠血清抗体亚类检测

空白对照及B-NDG®(B-NSGTM小鼠OD值均在0.04左右,BALB/c小鼠OD值显著高于B-NDG®(B-NSGTM小鼠,可认为B-NDG®(B-NSGTM小鼠血清中无IgGIgM存在。


   1.9.3. 小鼠血清抗体IgG亚型检测

                                                                                                图3.png

图3. B-NDG®(B-NSGTM)小鼠血清抗体IgG亚型检测

空白对照孔OD450均在0.06左右,本底值低于0.1,说明捕获抗体、酶标抗体和BSA之间没有交叉反应。分别检测BALB/c小鼠和B-NDG®(B-NSGTM小鼠血清IgG1IgG2aIgG2bIgG3BALB/c小鼠体内存在IgG各亚类抗体,B-NDG®(B-NSGTM小鼠血清中不存在IgG各亚类抗体(n=3)。

结果表明:B-NDG®(B-NSGTM小鼠作为缺失T细胞、B细胞的重度免疫缺陷模式小鼠,体内不存在任何类型的Ig抗体。

  

      1.9.4. 缺失成熟的T细胞、B细胞和NK细胞

  图4.jpg                                                                                        

图4. B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的T 、B和NK细胞的完全缺失。

取BALB/c、NOD-scid和B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的脾脏细胞,并通过流式对比其中T 、B和NK细胞的组成(A)并进行统计对比(B)


1.9.5. B-NDG®(B-NSGTM)小鼠NK细胞和巨噬细胞检测。

图5.png
    图5. 流式检测B-NDG®(B-NSGTM)小鼠血液和脾脏细胞中NK细胞比例

结果显示: 在C57BL/6小鼠的脾脏和血液中均可检测到NKp46的表达;在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠中未检测到NKp46的表达,表明B-NDG®(B-NSGTM)小鼠中没有NK细胞。

图6.png

       图6. 流式检测B-NDG®(B-NSGTM)小鼠脾脏细胞中巨噬细胞比例

分离C57BL/6小鼠和B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的脾脏细胞进行流式检测,选取Ly6c-细胞群进行CD11blow mF4/80+ 分群检测

结果显示:C57BL/6小鼠和B-NDG®(B-NSGTM)小鼠均有巨噬表达,并且与C57BL/6小鼠比较B-NDG®(B-NSGTM)小鼠中巨噬细胞比例较高。


1.9.6.    血常规指标


图7-1.png

图7-2.png

     图7. B-NDG®(B-NSGTM)小鼠血常规检测

对B-NDG®(B-NSGTM)小鼠进行血常规检测,各检测指标如下:

     

缩写

中文名称

WBC

白细胞数量

RBC

红细胞数量

Hb

血红蛋白浓度

HCT

红细胞压积

MCV

平均红细胞体积

MCH

平均红细胞血红蛋白含量

MCHC

平均红细胞血红蛋白浓度

RDW

红细胞(红细胞量)分布宽度

PLT

血小板数量

MPV

平均血小板容量

NE#

嗜中性粒细胞数量

NE%

嗜中性粒细胞百分比

LY#

淋巴细胞数量

LY%

淋巴细胞百分比

EO#

嗜酸性粒细胞数量

EO%

嗜酸性粒细胞百分比

MO#

单核细胞数量

MO%

单核细胞百分比

BA#

嗜碱细胞数量

BA%

嗜碱细胞百分比


1.9.7.    血生化检测

生化分析仪:Thermo Fisher scientific # Indiko

样品:血清或血浆

图8.png

图8. B-NDG®(B-NSGTM)小鼠血生化检测

对B-NDG®(B-NSGTM)小鼠进行血生化检测,各检测指标如下:

 

简写

中文名称

检测意义

ALT

丙氨酸氨基转移酶

升高表示肝功能受损

AST

天冬氨酸氨基转移酶  

升高表示肝细胞坏死

CHOL

胆固醇

升高表示血脂升高

CR

肌酐

升高表示肾小球滤过功能下降

GLU

葡萄糖

高血糖或低血糖症

TRIG

甘油三酯  

升高表示血脂升高  

UREA

尿素

升高表示可能有肾功能损伤,肝脏疾病,糖尿病或感染。


1.10.      饲养


1.10.1. 饲养注意事项


1.10.1.1.     B-NDG®(B-NSGTM)小鼠饲养环境需要注意哪些问题?

百奥赛图的B-NDG®(B-NSGTM)小鼠都是在隔离软包中饲养繁殖的,没有在IVC环境繁殖过,根据我们公司的经验,在严格水平的IVC环境(SPF级别)饲养时,可以保证小鼠2个月的健康存活时间,并能满足多数的实验项目要求;

但是鉴于国内动物房管理及微生物水平参差不齐,我们不能保证在所有IVC环境下一定都能健康饲养,建议一定要尽量提高现有IVC动物房的洁净标准,如饲养笼具和垫料都要经过高压灭菌或Co60辐照,并保证一周更换1次,操作要在无菌操作台进行等。越干净的环境越能保证小鼠更长时间的健康生长!

      

      1.10.1.2.     B-NDG®(B-NSGTM)小鼠饲养中注意事项

1)    饲料

百奥赛图繁殖生产使用的是美国Labdiet公司的专用饲料5CJL,蛋白含量19.3%,脂肪含量6.2%,并且维生素K含量达到20ppm(高压前),采用的灭菌方式是Co60辐照灭菌,可以保证小鼠的健康生长繁殖。

如果是国内饲养B-NDG®(B-NSGTM)小鼠用于实验,不进行繁殖,也可用国内饲料,我们建议使用科奥协力的饲料SPF大小鼠生长繁殖饲料,蛋白含量22.7%,脂肪含量4.7%,且已经过Co60照射,在SPF级别(IVC环境)下饲养,也可以健康生长至少2个月。

注:推荐使用美国Labdiet公司的专用饲料5CJL。

2)    饮水

百奥赛图是在隔离器中饲养,符合高级别的无病原体环境,采用的是高压后的纯水作为饮用水。

如果其他实验室要在普通SPF级别饲养,建议按照Jackson Lab的标准,采用酸化水(用HCl调节PH至2.5-3.0),之后再高压灭菌,可有效预防假单胞菌和金黄色葡萄球菌的污染,也可采用纯水直接灭菌,但一定要及时更换饮用水及水瓶,在饲养过程中,无论水瓶中的水是否饮用完,应当每3天更换一次新的水瓶。

3)    垫料

建议垫料使用刨花垫料,材质柔软蓬松、吸湿性强、无尘、无杂质、无异味,经过高压或者辐照灭菌处理。

垫料每周更换一次,如不在隔离包饲养,需要在超净工作台更换垫料,而且需要使用消毒过的镊子转移小鼠到新的笼盒,避免用手直接接触小鼠。

4)    环境

在饲养过程中,保证足够的光照强度(太强或太弱都不行)和光照时间,一般采用12小时光照,12小时黑暗的饲养模式。

环境温度保持在20-26℃,日温差不超过4℃。

饲养笼盒材质要无毒无害,便于清洁和消毒。每周至少要清洗消毒一次。

1.png


1.10.2. 运输

百奥赛图B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的运输可以采用陆运和空运两种方式,运输过程中我们尽量保证轻拿轻放避免小鼠在途中颠簸。但小鼠在运输过程中依然可能会有应激反应,加速小鼠的代谢和排泄,小鼠有可能出现不同程度的脱水状况导致体重减轻。尽管我们在运输箱内添加了果冻供动物采食,但长途运输应激仍会使一些小鼠出现体重减轻现象。一般运输所造成的小鼠体重消耗为10%左右,如果运输时间长、路途远、装箱密度大,体重消耗可能达到15%。不过这种情况一般经过5-7天的适应性饲养(建议使用Labdiet饲料),大部分体重便可恢复(不能100%同步恢复)。


1.10.3. 适应性饲养

1)    为什么要进行适应性饲养?

所谓适应性饲养,是指实验动物由繁殖地转移到实验动物房以后,在实验之前,为了使之适应环境而喂养几天的过程。因为运输、转移过程中,动物会有应激反应,为消除应激反应,一般需要为期5-7天的适应性饲养。

2)    适应性饲养过程中注意哪些问题?

配置好饲养的条件,按照第1.9.2所规定。努力使之在“新家”舒服地过日子。密切观察其毛发、排泄物、活动情况,这是考察动物是否有疾病的外在表现。注意与实验室原有饲养的动物隔开一定的距离,其它动物的声音、排泄的氨会对新来的动物有一定的影响。适应性饲养是保证实验成功的前提之一。

 

2.    CDX肿瘤模型

2.1.     利用B-NDG®(B-NSGTM)小鼠成功构建Raji细胞转移瘤模型

图9.jpg

图9. Raji淋巴肿瘤细胞在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠上能更有效地建立系统和转移肿瘤模型。

对B-NDG®(B-NSGTM)、NOD-scid、BALB/c Nude小鼠通过尾静脉注射相同数量(5 × 105)的Raji细胞,后在不同的时间点记录并分析小鼠的如下各种指标。

A.  细胞接种后记录小鼠生存情况,绘制Kaplan-Merier生存曲线。

B.  细胞接种后每周小鼠体重变化(g),并计算出相对于接种当天的相对体重。

C.  小鼠外周血中人源细胞百分率变化。接种Raji细胞后,每周通过眼眶静脉丛采取100 μl全血,提取DNA,通过q-PCR技术检测小鼠外周血中人源细胞比率。

D. 接种Raji细胞后小鼠肝脏对比。接种后待小鼠体重下降超过30%后执行安乐死并解剖脏器,进行拍照。

E.  接种Raji细胞后小鼠脏器免疫组化染色。一抗为鼠抗人线粒体膜蛋白抗体。


     2.2.  已成功建立的CDX肿瘤模型

示例:


Cell lines

Tumor type

Cell lines

Tumor type

Human   solid tumor cell lines

NCI-H1975

Lung carcinoma,non-small cell

ZR-75-1

Breast ductal carcinoma

HCC827

Lung adenocarcinoma

MDA-MB-231

Breast adenocarcinoma

NCI-H520

Lung carcinoma

DU4475

Breast carcinoma, triple negative

A549

Lung carcinoma

MCF7

Mammary gland, breast adenocarcinoma

NCI-H1781

Lung carcinoma bronchoalveolar

5637

Bladder grade II carcinoma

HCT-8

Colorectal Ileocecal adenocarcinoma

A431

Epidermoid carcinoma

HCT-116

Colon carcinoma

LN229

Glioblastoma

Colo205

Colorectal adenocarcinoma

Miapaca-2

Pancreatic carcinoma

Human   blood tumor cell lines

Daudi

Lymphoma,

NAMALWA

Burkitt's lymphoma

KG-1

Leukemia,acute myelogenous (AML)

Kasumi-1

Leukemia, acute myeloblastic (AML)

Raji

Lymphoma,Burkitt's

SU-DHL-1

Large cell lymphoma, Ddiffuse histiocytic lymphoma

K562

Leukemia (CML)

MV4-11

Peripheral blood biphenotypic B myelomonocytic leukemia


2.3.   B-NDG®(B-NSGTM)小鼠 CDX淋巴癌药效实验

A

图10-1.png


B     

                  图10-2.jpg

图10. 对B-NDG®(B-NSGTM)小鼠通过尾静脉注射相同数量(5 × 105)的Raji-Fluc细胞,并在第3天以及第10天尾静脉注射相同计量的抗体X,之后在不同的时间点成像观察肿瘤生长状况。

A.    不同时间点对小鼠成像观察肿瘤生长情况

B.     不同分组小鼠成像下肿瘤细胞荧光强度曲线

结果表明,早期治疗(Raji细胞移植3天,10天)的治疗效果显著,晚期治疗(Raji细胞移植10天)的治疗效果明显变差,基本无效。


A

              图11-1.jpg

 

 

B

              图11-2.jpg


图11. 首先,在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠上重建CD34+T细胞,静脉注射5 × 105 Raji-Fluc细胞,5天后再给小鼠静脉注射人源PD-1抗体,2天后可见抗体对肿瘤细胞有明显的抑制作用。

结果表明,B-NDG®(B-NSGTM)小鼠是人免疫系统重建及CDX药效试验的有效模型。

 

3.    PDX肿瘤模型

近十年来PDX(Patient-Derived Xenograft)模型的广泛应用已经证实它们在肿瘤药物的临床前评估以及临床疗效预测方面具有非常好的应用前景。规模化的PDX模型对抗癌药物的药效结果反映了抗癌药物在病人群体中的临床应用结果。因此,用PDX模型库进行抗癌新药的临床前药效研究可以对新药的临床应用潜力进行更深入的评估,有重要的应用价值。

3.1.    B-NDG®(B-NSGTM)鼠与CB17-scid鼠比较有明显的PDX建模优势


A                                                           B

      图12-a.jpg                         图12-b.jpg 

      

C

Gastric   Cancer

CB17-scid

B-NDG®(B-NSGTM

ID

Tumor size to 250 mm3

Tumor size to 250 mm3

Tumor doubling time

1

--

40 days

7 days

2

--

56 days

5 days

3

--

66 days

10 days

4

--

--

--

5

--

--

--

6

--

40 days

5 days


Tumor take rate 0%(0/6)

Tumor take rate 66.7%(4/6)

Average doubling time 6.75 days

图12. 临床病人胃癌组织样本成功移植入B-NDG®(B-NSGTM)小鼠

A. 病人胃癌样品在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠皮下接种并成瘤;

B. 病人胃癌样品在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠体内的肿瘤生长曲线;

C. 病人胃癌样品在CB17-scid 和B-NDG®(B-NSGTM)小鼠体内的成瘤率比较


3.2.   基于B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的个体化PDX建模服务

3.2.jpg


3.3.    基于B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的PDX模型及药效验证


图13.jpg

图13. 不同药物对同一种胃癌PDX模型药效试验效应不同。

通过对PDX模型采用不同联合用药方案,积累药物的临床前动物试验的数据资料,以动物实验资料辅助临床治疗方案的决定

规模化的PDX模型在肿瘤异质性方面更加丰富,每个PDX模型可以作为单一病人肿瘤代表,充分体现了病人群体特征。因此,将临床研发的肿瘤新药在多个PDX模型中进行药效测定对展现药物在特定部分病人中的疗效有重要意义。

 

4.    人免疫系统重建模型及药效评价

4.1.   利用人外周血细胞(hPBMCs)获得人免疫系统重建的B-NDG®(B-NSGTM)小鼠

 图14.jpg


图14. 人外周血单个核细胞(hPBMCs, human peripheral blood mononuclear cells) 在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的成功接种。

通过尾静脉注射5x106人外周血细胞(hPBMCs)进B-NDG®(B-NSGTM)小鼠,24天后取血流式检测hCD45+和mCD45+的比例。

结果表明,人外周血细胞(hPBMCs)在3只B-NDG®(B-NSGTM)小鼠都得到了较好的重建,且进一步分析表明,外周血细胞重建以T细胞为主。


4.2.         利用人造血干细胞(CD34+)获得人免疫系统重建的B-NDG®(B-NSGTM)小鼠

图15.jpg

图15. 利用人造血干细胞(CD34+)在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠体内重建免疫系统。

B-NDG®(B-NSGTM)小鼠经辐照后,尾静脉注射CD34+细胞,检测小鼠存活率与体重变化(n=5)。结果表明,重建的CD34+细胞有效延长了辐照后B-NDG®(B-NSGTM)小鼠的生存时间。

图16.jpg

图16. B-NDG®(B-NSGTM)小鼠经过辐照,尾静脉接种2x105 CD34+细胞,流式分析统计,CD34+细胞重建B-NDG®(B-NSGTM)小鼠免疫系统后,人源细胞随时间变化曲线。

结果表明,人免疫细胞在B-NDG®(B-NSGTM)小鼠上得到了成功重建。

 

A

图17a.jpg


B

图17b.jpg


图17. 流式分析统计,CD34+细胞重建B-NDG®(B-NSGTM)小鼠免疫系统后,人源细胞的分化分析。

         结果表明,CD34+细胞移植10周后,小鼠体内人源B细胞、T细胞和NK细胞都成功重建,而对照组(未注射CD34+细胞)的小鼠无人源细胞(结果未展示)

 

5.    部分合作单位

清华大学.png中山大学.png浙江大学.png四川大学.png

武汉大学.png北京大学人名医院.png上海交通大学.pngSIMM.png

南京医科大学.png中山大学孙逸仙医院.png复旦.png动物所.png瑞金医院.png吉林大学.png鸟.png

新桥医院.png厦门大学.png


6.    参考文献

 

1.      Xinhua Xiao, Huiliang Li, Huizi Jin, Jin Jin, Miao Yu, Chunmin Ma, Yin Tong, Li Zhou, Hu Lei, Hanzhang Xu, Weidong Zhang, Wei Liu, and Yingli Wu. 2017. Identification of 11(13)-dehydroivaxillin as a potent therapeutic agent against non-Hodgkin's lymphoma. Cell death & disease. 8(9):e3050. 

2.     Ito M, Hiramatsu H, Kobayashi K, Suzue K, Kawahata M, Hioki K, Ueyama Y, Koyanagi Y, Sugamura K, Tsuji K, Heike T, Nakahata T. 2002. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood 100(9):3175-82. [PMID: 12384415]

3.      Shultz LD, Lyons BL, Burzenski LM, Gott B, Chen X, Chaleff S, Kotb M, Gillies SD, King M, Mangada J, Greiner DL, Handgretinger R. 2005. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174(10):6477-89. [PMID: 15879151]

4.   McDermott SP, Eppert K, Lechman ER, Doedens M, Dick JE. 2010. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood 116(2):193-200. [PMID: 20404133]

5.      Lepus CM, Gibson TF, Gerber SA, Kawikova I, Szczepanik M, Hossain J, Ablamunits V, Kirkiles-Smith N, Herold KC, Donis RO, Bothwell AL, Pober JS, Harding MJ. 2010. Comparison of human fetal liver, umbilical cord blood, and adult blood hematopoietic stem cell engraftment in NOD-scid/gammac-/-, Balb/c-Rag1-/-gammac-/-, and C.B-17-scid/bg immunodeficient mice. Blood 70(10):790-802. [PMID: 19524633]

6.      Shultz LD1, Brehm MA, Bavari S, Greiner DL. 2011. Humanized mice as a preclinical tool for infectious disease and biomedical research. Ann N Y Acad Sci 1245:50-4. [PMID: 22211979]

7.      Covassin L1, Jangalwe S, Jouvet N, Laning J, Burzenski L, Shultz LD, Brehm MA. 2013. Human immune system development and survival of non-obese diabetic (NOD)-scid IL2rγ (null) (NSG) mice engrafted with human thymus and autologous haematopoietic stem cells. Clin Exp Immunol 174(3):372-88. [PMID: 23869841]

8.   Wege AK, Schmidt M, Ueberham E, Ponnath M, Ortmann O, Brockhoff G, Lehmann J. 2014. Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies. MAbs 6(4):968-77. [PMID: 24870377]

      

B-NDG小鼠说明书.pdf



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