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HITI技术基因敲除细胞系

2017-07-14 10:45:58.0

技术背景

继ZFN和TALEN之后,在2013年[1]开始成熟的CRISPR/Cas9技术极大促进了基因编辑领域的发展。

现在最常用的基于CRISPR/Cas9的基因敲除细胞系制备方法为:将表达Cas9/sgRNA的质粒瞬时转染细胞,挑取单克隆进行基因型鉴定。但由于永生化细胞系一般为4-5倍体,即某个基因至少为4-5个拷贝,因此得到全敲除单克隆的概率很低。所以人们一般在Cas9/sgRNA质粒骨架中加入真核筛选标记,瞬时转染后利用这个标记进行短期的转染阳性富集。

我们的数据表明,即使是短时间(3天左右)的抗性富集,也会造成最终超过50%的单克隆发生了质粒的稳定整合。这些整合的质粒会持续地表达Cas9/sgRNA,过量的Cas9/sgRNA会极大增加脱靶切割概率,造成非目的基因的破坏,最终影响细胞的功能性分析。


HITI技术简介

2016年,Suzuki, K.[2]等人在研究中发现,当在细胞中提供线性的DNA片段,同时利用Cas9/sgRNA在靶位点造成双链断裂,线性DNA会高频率地插入到断裂位置。这种基于NHEJ(Non-homologous end joining)机制的现象被称为“不依赖于同源的靶向整合”(HITI, homology-independent targeted integration)。


HITI技术的优势

  • 敲除效率高

  • 潜在脱靶率低

  • 制备时间更短

  • 制备价格更低


百奥赛图基于HITI的基因敲除细胞系制备技术

利用HITI技术可以避免上述仅利用Cas9/sgRNA质粒的方法的弊端。细胞转染后,可以使用靶向整合的抗性基因进行筛选。在Cas9/sgRNA质粒中不存在筛选元件,从而在极大程度上可以避免Cas9/sgRNA质粒的整合,也避免了相应的脱靶概率的增加。

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图1 . HITI技术可以通过两种方式实现基因敲除。第一种为线性抗性基因DNA靶向整合到编码区的Cas9/sgRNA切口处;第二种为Cas9/sgRNA切割导致的移码突变。

图2. 在基因型鉴定时,引物设计在切割位点两侧。PCR产物电泳中偏大的条带为HITI allele,偏小的条带为野生型(WT, Wild type)或者发生了NHEJ的allele。


HITI技术制备敲除细胞流程图

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成功案例

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图4. HITI技术展现出高效的基因敲除效率

我们将靶向CD155基因的相关质粒转染HepG2细胞并进行抗性筛选,使用流式细胞术 (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter) 检测混合细胞群中CD155的敲除情况。数据显示有84%的细胞呈现CD155阴性信号。


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图5. 敲除细胞系的基因型鉴定结果展示

将混合群细胞进行单克隆后,对单克隆进行基因型鉴定。#1克隆在PCR鉴定中显示只存在HITI allele,表明所有的等位基因都发生了靶向整合破坏。#2克隆的靶位点测序结果显示序列发生了1bp的插入,从而导致移码突变。


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图6. 敲除细胞系无CD155 蛋白表达

我们又使用anti-human CD155的抗体和流式细胞术对这两个克隆进行了检测,发现#1和#2克隆已经无法检测到目的基因的表达。

除此以外,我们使用HITI技术在MC38,K562,A549等细胞系中均得到了类似的成功案例。

HITI技术不仅在一定程度上减轻了Cas9/sgRNA的脱靶切割问题,同时也减少了需要测序鉴定的等位基因的拷贝数,使得细胞系的基因敲除变得更加高效和简便。

 

参考文献

1. Cong, L., et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013. 339(6121): p. 819-23.

2. Suzuki, K., et al., In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature, 2016. 540(7631): p. 144-149.


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