背景概述

B-NDG^®小鼠（NOD.CB17-Prkdc^scidIl2rg^tm1/Bcgen）是百奥赛图公司自主开发的，NOD-scid遗传背景的Il2rg基因敲除小鼠，缺乏成熟的T、B和NK细胞，是目前国际公认的免疫缺陷程度高、非常适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。

• NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。

• Prkdc null（DNAPK,scid）：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T和B细胞缺失，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immunedeficiency, scid）。

• Il2rg null：Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。

B-NDG^®小鼠：综合了NOD-scid-Il2rg null背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。

B-NDG 小鼠优势

• 世界公认的重度免疫缺陷小鼠

• 与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年

• 对人源细胞和组织几乎没有排斥反应

• 少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型

• 无B淋巴细胞泄漏

主要应用领域

• 人源细胞或组织移植

• 肿瘤和肿瘤干细胞研究

• ES和iPS细胞研究

• 造血和免疫学研究

• 人类疾病感染模型研究

• 新的人源化动物模型研发

B-NDG商标申请

百奥赛图(北京）生物医药科技股份有限公司分别对“B-NDG”进行了第5类、第31类、第42类和第44类进行了商标申请。各字母代表含义：B-Biocytogen; N-NOD background; D- DNAPK(Prkdc) null; G- G: IL2rg knockout。

第5类：人用药；医用水蛭；医用生物标志物诊断试剂；医用或兽医用微生物培养物；医用营养食物；净化剂；兽医用制剂；杀虫剂；医用填料；兽医用干细胞（截止）

第31类：活动物；活家禽；活鱼；甲壳动物（活的）；树木；谷（谷类）；植物；植物种子；动物栖息用干草；饲料（截止）

第42类：质量控制；化学研究；生物学研究；临床试验；材料测试（截止）

第44类：医药咨询；医院；人工授精；饮食营养指导；动物养殖；兽医辅助；人工授精（替动物）；试管授精（替动物）；卫生设备出租；试管授精（截止）

小鼠饲养注意事项

B-NDG^®小鼠饲养环境需要注意哪些问题？

百奥赛图的B-NDG^®小鼠都是在隔离软包中饲养繁殖的，没有在IVC环境繁殖过，根据我们公司的经验，在严格水平的IVC环境（SPF级别）饲养时，可以保证小鼠2个月的健康存活时间，并能满足多数的实验项目要求；

但是鉴于国内动物房管理及微生物水平参差不齐，我们不能保证在所有IVC环境下一定都能健康饲养，建议一定要尽量提高现有IVC动物房的洁净标准，如饲养笼具和垫料都要经过高压灭菌或Co60辐照，并保证一周更换1次，操作要在无菌操作台进行等。越干净的环境越能保证小鼠更长时间的健康生长！

B-NDG^®小鼠饲养中注意事项

饲料

      百奥赛图繁殖生产使用的是美国Labdiet公司的专用饲料5CJL，蛋白含量19.3%，脂肪含量6.2%，并且维生素K含量达到20ppm（高压前），采用的灭菌方式是Co60辐照灭菌，可以保证小鼠的健康生长繁殖

      如果是国内饲养B-NDG^®小鼠用于实验，不进行繁殖，也可用国内饲料，我们建议使用科奥协力的饲料“SPF大小鼠生长繁殖饲料”，蛋白含量22.7%，脂肪含量4.7%，且已经过Co60照射，在SPF级别（IVC环境）下饲养，也可以健康生长至少2个月。

注:推荐使用美国Labdiet公司的专用饲料5CJL。

饮水

     百奥赛图是在隔离器中饲养，符合高级别的无病原体环境，采用的是高压后的纯水作为饮用水。

如果其他实验室要在普通SPF级别饲养，建议按照Jackson Lab的标准，采用酸化水（用HCl调节PH至2.5-3.0），之后再高压灭菌，可有效预防假单胞菌和金黄色葡萄球菌的污染，也可采用纯水直接灭菌，但一定要及时更换饮用水及水瓶，在饲养过程中，无论水瓶中的水是否饮用完，应当每3天更换一次新的水瓶。

垫料

   建议垫料使用刨花垫料，材质柔软蓬松、吸湿性强、无尘、无杂质、无异味，经过高压或者辐照灭菌处理。

垫料每周更换一次，如不在隔离包饲养，需要在超净工作台更换垫料，而且需要使用消毒过的镊子转移小鼠到新的笼盒，避免用手直接接触小鼠。

环境

    在饲养过程中，保证足够的光照强度（太强或太弱都不行）和光照时间，一般采用12小时光照，12小时黑暗的饲养模式。

    环境温度保持在20-26℃，日温差不超过4℃。

    饲养笼盒材质要无毒无害，便于清洁和消毒。每周至少要清洗消毒一次

运输

百奥赛图B-NDG^®小鼠的运输可以采用陆运和空运两种方式，运输过程中我们尽量保证轻拿轻放避免小鼠在途中颠簸。但小鼠在运输过程中依然可能会有应激反应，加速小鼠的代谢和排泄，小鼠有可能出现不同程度的脱水状况导致体重减轻。尽管我们在运输箱内添加了果冻供动物采食，但长途运输应激仍会使一些小鼠出现体重减轻现象。一般运输所造成的小鼠体重消耗为10%左右，如果运输时间长、路途远、装箱密度大，体重消耗可能达到15%。不过这种情况一般经过7-15天的适应性饲养（建议使用Labdiet饲料），大部分体重便可恢复（不能100%同步恢复）。

适应性饲养

1)为什么要进行适应性饲养？

所谓适应性饲养，是指实验动物由繁殖地转移到实验动物房以后，在实验之前，为了使之适应环境而喂养几天的过程。因为运输、转移过程中，动物会有应激反应，为消除应激反应，一般需要为期7-15天的适应性饲养。

2)适应性饲养过程中注意哪些问题？

配置好饲养的条件，按照第1.10.1所规定。努力使之在“新家”舒服地过日子。密切观察其毛发、排泄物、活动情况，这是考察动物是否有疾病的外在表现。注意与实验室原有饲养的动物隔开一定的距离，其它动物的声音、排泄的氨会对新来的动物有一定的影响。适应性饲养是保证实验成功的前提之一。

表型分析

小鼠生长曲线

图1. B-NDG小鼠生长曲线

雌雄小鼠各50只，小鼠3周龄断奶后（出生日期±3天）每周固定日期进行称重，数据收集共13周。

小鼠血清抗体检测

图2. B-NDG^®小鼠血清抗体亚类检测

(A)空白对照及B-NDG小鼠OD值均在0.04左右，BALB/c小鼠OD值显著高于B-NDG 小鼠，可认为B-NDG 小鼠血清中无IgG和IgM存在。(B)空白对照孔OD450均在0.06左右，本底值低于0.1，说明捕获抗体、酶标抗体和BSA之间没有交叉反应。分别检测BALB/c小鼠和B-NDG 小鼠血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，BALB/c小鼠体内存在IgG各亚类抗体，B-NDG小鼠血清中不存在IgG各亚类抗体（n=3）。

结果表明：B-NDG小鼠作为缺失T细胞、B细胞的重度免疫缺陷模式小鼠，体内不存在任何类型的Ig抗体。

T细胞、B细胞和NK细胞的检测

图3. B-NDG小鼠的T 、B和NK细胞的完全缺失

从 C57BL/6N、NOD-scid 和B-NDG小鼠（n=3，6 周龄，雌性）中分离血细胞，脾细胞，骨髓。对其进行流式细胞术分析，以评估白细胞亚群。 (A) 代表性流式图。 (B) FACS 分析结果，在 C57BL/6N 小鼠中可检测到 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞，在NOD-scid小鼠中可检测到NK细胞，但在 B-NDG 小鼠中均未检测到。

髓系细胞免疫分型

图4. B-NDG小鼠的髓系细胞分型

从 C57BL/6N、NOD-scid 和B-NDG小鼠（n=3，6 周龄，雌性）中分离血细胞，脾细胞，骨髓。对其进行流式细胞术分析，以评估髓系细胞亚群。结果显示，在B-NDG小鼠中可检测到髓系细胞。

Granulocytes :mCD45+mGr-1+， DCs:mCD45+mCD11c+, Macrophages:mCD45+mCD11b+mF4/80+,

Monocytes: mCD45+mCD11b+mF4/80-.

B-NDG脾脏组织学检测

图5.小鼠脾脏组织切片及HE染色

取C57BL/6、NOD-scid 和 B-NDG小鼠（n = 3，9 周龄，雌性）脾脏，对脾脏样本进行组织切片及HE染色。结果显示：C57BL/6 小鼠脾脏结构正常，滤泡清晰。NOD-scid 小鼠的脾脏显示白髓发育不全。B-NDG 小鼠的脾脏显示滤泡结构完全丧失。

B-NDG脾脏组织学检测

图6.小鼠脾脏组织切片及IHC染色

取C57BL/6、NOD-scid 和 B-NDG小鼠（n = 3，9 周龄，雌性）脾脏，对脾脏样本进行组织切片及IHC染色。结果显示：C57BL/6 小鼠脾脏 CD3ε 和 CD19 表达正常（棕色），小鼠 B-NDG 小鼠无 CD3ε 和 CD19 表达。

血常规检测

图 7. B-NDG 小鼠的全血细胞计数 (CBC)

试验采集 B-NDG 小鼠（n = 6，6 周龄，雌）的血液并分析 CBC。数值表示为平均值±SEM。

血生化检测

图 8. B-NDG 小鼠血液生化检测结果 。

采集 B-NDG 小鼠(n = 6，6 周龄，雌)的血清，并分析 ALT、AST、CHOL、CR、GLU、TRIG 和 UREA 的水平。数值表示为平均值±SEM。仪器：Thermo Fisher scientific#Indiko

CDX 肿瘤模型及药效评价

CDX 淋巴癌转移模型

图9. Raji淋巴肿瘤细胞在B-NDG^®小鼠上能更有效地建立系统和转移肿瘤模型。

对B-NDG^®、NOD-scid、BALB/c Nude小鼠通过尾静脉注射相同数量（5 × 10⁵）的Raji细胞，后在不同的时间点记录并分析小鼠的如下各种指标。

A.细胞接种后记录小鼠生存情况，绘制Kaplan-Merier生存曲线。

B.细胞接种后每周小鼠体重变化(g)，并计算出相对于接种当天的相对体重。

C.小鼠外周血中人源细胞百分率变化。接种Raji细胞后，每周通过眼眶静脉丛采取100 μl全血，提取DNA，通过q-PCR技术检测小鼠外周血中人源细胞比率。

D.接种Raji细胞后小鼠肝脏对比。接种后待小鼠体重下降超过30%后执行安乐死并解剖脏器，进行拍照。

E.接种Raji细胞后小鼠脏器免疫组化染色。一抗为鼠抗人线粒体膜蛋白抗体。

B-NDG^®小鼠 CDX淋巴癌体内药效实验

图10. 基于B-NDG小鼠的Raji淋巴癌转移模型及药效评价

对B-NDG^®小鼠通过尾静脉注射相同数量（5×10⁵）的Raji-Fluc细胞，并在第3天以及第10天尾静脉注射相同计量的抗体X，之后在不同的时间点成像观察肿瘤生长状况。A.不同时间点对小鼠成像观察肿瘤生长情况；B.不同分组小鼠成像下肿瘤细胞荧光强度曲线。结果表明，早期治疗（Raji细胞移植3天，10天）的治疗效果显著，晚期治疗（Raji细胞移植10天）的治疗效果明显变差，基本无效。

B-NDG^®小鼠进行抗人CD47抗体药效验证实验

图11.利用B-NDG^®小鼠进行抗人CD47抗体药效验证实验

图10.抗人CD47抗体在B-NDG小鼠中的抗肿瘤活性。
将人B-荧光素酶-GFP Raji细胞（B淋巴细胞）尾静脉植入B-NDG。当荧光强度达到约1.0E + 06(n = 6)时，将小鼠分组，此时用抗人CD47抗体处理，剂量和时间表如图A所示。(A)荧光成像仪用于监测小鼠中的肿瘤荧光。(B)给药期间的体重变化。结果表明，3种抗体对B-NDG小鼠的肿瘤生长抑制有效。B-NDG是人CD47抗体有效性研究的有力模型。数值表示为平均值±SEM。

B-NDG^®小鼠进行CAR-T药效验证实验

图 12.CAR-T 疗法在 B-NDG 小鼠中的抗肿瘤活性。

将B-luciferase-GFP Raji cells (B lymphocytes)尾静脉植入 B-NDG小鼠。当荧光强度达到约 1E + 06 (n = 6) 时，将小鼠分组，用CAR-T 细胞 (1E + 07) 处理。(A) Raji-Luciferase 细胞系经不同 CAR-T 细胞处理后的信号强度；(B) 处理期间的体重变化。结果显示，4 种 CAR-T 细胞在 B-NDG 小鼠中表现出不同地抑制肿瘤生长活性。结果表明：B-NDG 小鼠可以作为 CAR-T 细胞治疗研究的有力模型。数值表示为平均值±SEM。

人免疫系统重建模型及药效评价

利用B-NDG 小鼠进行PBMCs免疫重建

图19.FACS法分析外周血淋巴细胞亚群

将人PBMC细胞(5E6)静脉植入纯合子B-NDG小鼠（雌性，6周龄，n = 6）。植入huamn PBMC后不同时间取B-NDG小鼠血液进行流式细胞分析。B-NDG小鼠显示高百分比的人CD45 + 细胞，T细胞。B-NDG小鼠表现出体重减轻和生存期缩短，可能是由于高比例的人免疫细胞重建引起的GVHD效应。

利用PBMCs重建的B-NDG小鼠模型进行双特异性抗体药效评价

图 20 .使用 PBMC 细胞重建的 B-NDG 小鼠进行双特异性抗体药效研究

将人 B-luciferase-GFP Raji (5E5)、PBMC (5E6) 和抗体混合物静脉注射到 B-NDG 小鼠 (n = 4) 中。(A) 小动物成像仪监测小鼠肿瘤荧光。(B) 治疗期间的体重变化。单抗表现出明显的抑瘤效果，双特异性抗体的抑制作用更加显著。结果表明，使用 PBMC重建的B-NDG小鼠建立CDX肿瘤模型为体内评价抗体提供了有力的临床前模型。数值表示为平均值±SEM

人免疫系统重建模型和疗效评价

在使用人PBMC重建的B-NDG小鼠中评价双特异性抗体的体内药效

图20.使用PBMC细胞重建的B-NDG小鼠进行CD3×Claudin18.2双特异性抗体有效性研究。将人PBMC(5E6)静脉植入B-NDG小鼠（雌性，7周龄，n = 6）后，皮下植入NUGC4细胞(5E6)。当肿瘤大小约为50-80 mm³，人血液hCD45%百分比高于10%时，将动物分为对照组和给药组，此时给予药物处理。(A)抗人CD3×Claudin18.2双特异性抗体（AMG 910类似物）可抑制人PBMC重组B-NDG小鼠中的NUGC4肿瘤生长。(B)给药期间的体重变化。CD3×Claudin18.2双特异性抗体表现出明显的肿瘤抑制作用。结果表明，用重组PBMC建立B-NDG小鼠CDX肿瘤模型为抗体的体内评价提供了有力的临床前模型。数值表示为平均值±SEM。

利用B-NDG 小鼠成功建立HSC免疫重建模型

图21.利用人造血干细胞（CD34+）在B-NDG^®小鼠体内重建免疫系统。

(A) 重建人 CD34 + 细胞可延长受辐照 B-NDG 小鼠的寿命；(B) B-NDG小鼠和 进行CD34+重建的 B-NDG 小鼠在辐照后的体重变化；(C）将 2 x 10⁵ CD34+细胞植入 B-NDG 小鼠后，在不同的时间点连续测量人 CD45+细胞的百分比；(D) 人 CD45+细胞中人 CD19+ 细胞的百分比。(E) 人 CD3+ 细胞占人 CD45+ 细胞的百分比。结果表明利用B-NDG小鼠可以成功建立HSC人源化小鼠模型。

利用HSC免疫重建的 B-NDG 小鼠中进行的药物药效评价实验

图 22.使用 CD34+ 细胞重建的 B-NDG小鼠模型进行药效评价

利用人CD34+细胞重建的人源化 B-NDG 小鼠模型静脉注射人B-luciferase-GFP Raji 细胞 (5E5)。肿瘤细胞植入后5天，用人抗体 X 处理小鼠。在第7天观察到人抗体X对肿瘤细胞生长的显著抑制作用。结果表明，基于B-NDG的HSC人源化小鼠模型为体内抗体评价提供了有力的临床前模型。数值表示为平均值±SEM。 RC：Raji-Fluc Control. XH: Antibody X/humanized mice. naïve B-NDG: B-NDG mice without Raji-Fluc and antibody treatment.